【求助】应用引物在序列中引入蛋白标签
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发表于: 2014-8-30 16:00 作者: 松子儿 来源: 分析测试百科网
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打算应用引物在序列中引入蛋白标签flag，查到了大家的说法如下：
1. 酶切位点+5‘+ATG+FLAG+目的基因的CDS（目的基因的ATG可留可不留）+3’；只在上游引物的N端添加即可。
2. 我用的这个ATGGATTACAAGGATGACGACGATAAG
还没有分析蛋白结构所以我把上下游引物均进行了改造，我把我改造的放出来请大家帮我看看 ，我有没有理解正确：（引物中与目的基因匹配的用XXX替代）
A基因（上下游引物均起始与停止在起始子和终止子，也就是说直接在ORF两边加上了酶切位点，没有任何多余的碱基）
上游引物F ：CCC（保护碱基） AAGCTT（酶切位点） ATG(目的基因的起始密码子)XXX
修改后变成：上游引物F ：CCC（保护碱基） AAGCTT（酶切位点） ATG（用于起始标签）GATTACAAGGATGACGACGATAAG（标签序列） ATG(目的基因的起始密码子) XXX
下游引物：GC（保护碱基） GTCGAC（酶切位点） TCA（目的基因的终止密码子的反向互补）XXX
修改后变成： 下游引物：GC（保护碱基） GTCGAC（酶切位点）CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC（flag标签序列反向互补）CAT（起始密码子反向互补用于起始FLAG标签）TCA（目的基因的终止密码子的反向互补） XXX
B基因：（为了设计合适的引物在ORF前后均有一些多余的碱基）
上游引物F ：CCC（保护碱基） AAGCTT（酶切位点）XXX（此处起始碱基到目的基因的ATG碱基数为3的倍数）
修改后变成：上游引物F ：CCC（保护碱基） AAGCTT（酶切位点） ATG（用于起始标签）GATTACAAGGATGACGACGATAAG（标签序列）XXX（此处起始碱基到目的基因的ATG碱基数为3的倍数）
下游引物： GC（保护碱基） GTCGAC（酶切位点）XXX（此处终止碱基到终止子碱基数为19个）
修改后变成：下游引物： GC（保护碱基） GTCGAC（酶切位点）CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC（flag标签序列反向互补）CAT（起始密码子反向互补用于起始FLAG标签）GA(此两个碱基为随机加上的这样保证碱基数为21个)XXX（此处终止碱基到终止子碱基数为19个）
我已经尽力写清楚了，这两个基因囊括了在引物中引入标签序列的两大种情况，请大家费力帮我看一看，我有没有弄错，网上很多帖子说的都很不清楚，希望通过我的例子能让我也让大家弄清楚，谢谢
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whitesheep (2014-8-30 16:01:03)
好的，真的谢谢你，再请问一下，我打算把通过引物把标签加在蛋白上，怎么判断，或者是用什么蛋白分析软件可以判断，蛋白哪一端活性很重要不可以加标签，哪一端可以加标签呢？谢谢，期待
dragonkilly (2014-8-30 16:01:37)
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原帖由 whitesheep 于 2014-8-30 16:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
好的，真的谢谢你，再请问一下，我打算把通过引物把标签加在蛋白上，怎么判断，或者是用什么蛋白分析软件可以判断，蛋白哪一端活性很重要不可以加标签，哪一端可以加标签呢？谢谢，期待 ... 这个具体加在哪一段，影不影响蛋白功能这个还真不好说，如果是分泌蛋白就不要加在N端
松子儿 (2014-8-30 16:02:06)
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原帖由 dragonkilly 于 2014-8-30 16:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
这个具体加在哪一段，影不影响蛋白功能这个还真不好说，如果是分泌蛋白就不要加在N端 您好，我也问了一下，他们说我的B基因下游引物修改错了，不能在终止子以后21个碱基后再加flag标签序列，这个您怎么看
dragonkilly (2014-8-30 16:02:34)
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原帖由 松子儿 于 2014-8-30 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
您好，我也问了一下，他们说我的B基因下游引物修改错了，不能在终止子以后21个碱基后再加flag标签序列，这个您怎么看 在终止密码子后肯定是不能再加flag标签啦
松子儿 (2014-8-30 16:02:52)
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原帖由 dragonkilly 于 2014-8-30 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
在终止密码子后肯定是不能再加flag标签啦
那就是说 我把基因的ORF最后的终止密码子去掉，然后加上flag的基因序列，最后再加上终止密码子就行了吗？相对的上游引物就是把ORF起始密码子后面加上flag的序列，对不对？
uaubc (2014-8-30 16:03:53)
这样子的话就是对的。
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